Рус Eng Поиск Вк Telegram Адрес Тел                             


Главная страница ⇒ Наука и образование ⇒ Научно-исследовательские проекты ⇒ Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток
print

Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток


10.06.2015

Назад

Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток

Соглашение о предоставлении субсидии: 
соглашение от 22 августа 2014 года №14.607.21.0045
Научный руководитель: 
Всеволод Арсеньевич Ткачук
Координатор: 
Анастасия Юрьевна Ефименко
Подразделения: 
отдел координации научных и образовательных программ, научно-исследовательская лаборатория регенеративной медицины МНОЦ МГУ
Индустриальный партнер: 
ООО «Генная и клеточная терапия»

ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы"
Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток

Описание проекта

  При многих заболеваниях в значительном проценте случаев происходит необратимая утрата части тканей или органов, и задача их восстановления не может быть решена традиционными методами современной медицины. В связи с этим в настоящее время активно разрабатываются подходы регенеративной медицины, направленные как на создание замещающих поврежденные ткани конструкций exvivo, так и на стимуляцию эндогенных процессов репарации и регенерации. В организме человека физиологическое обновление и регенерация тканей происходят в течение всей жизни благодаря стволовым и прогениторным клеткам. К ним относятся мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК), которые могут быть легко выделены в достаточном количестве из жировой ткани. Значительное число данных свидетельствует, что МСК жировой ткани человека, культивируемые в стерильных условиях, секретируют в культуральную среду многочисленные факторы роста и цитокины, которые играют первостепенную роль в процессах регенерации и репарации тканей.
  Целью проекта является создание технологии производства материала на основе стандартизированного препарата среды культивирования стволовых клеток, содержащей продукты их секреции, комбинированного с коллагеном в качестве матрицы, который может быть использован для замещения поврежденных тканей и стимуляции регенеративных процессов. В рамках данного проекта разрабатываемый материал планируется апробировать на экспериментальных моделях для лечения повреждений кожи, стенки мочевого пузыря и восстановления фертильности.

Первый этап проекта
   В ходе выполнения первого этапа проекта выполнялись следующие работы:
аналитический обзор информационных источников; проведение патентных исследований; формирование критериев включения и исключения доноров клеточного материала; разработка паспортов на образцы клеточного материала, содержащих сведения о доноре и клеточном материале; сбор биологического материала для выделения МСК человека; разработка стандартных операционных процедур (СОП) выделения, наращивания, иммунофенотипирования и контроля контаминации МСК жировой ткани человека для получения кондиционированной среды; выделение, наращивание, иммунофенотипическая и контаминационная характеристика МСК жировой ткани человека; формирование охарактеризованной коллекции МСК жировой ткани человека для получения кондиционированной среды; отработка и стандартизация процедуры производства субстанции, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека; разработка СОП лабораторного производства субстанции, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.
При этом были получены следующие результаты:
  Был проведен аналитический обзор информационных источников и определены основные направления работы. Проведены патентные исследования. Показана актуальность разработки новых материалов для регенеративной медицины, приближенных по своим свойствам к тканям организма человека, к которым относится разрабатываемый в рамках проекта материал на основе секретируемых компонентов стволовых клеток и коллагеновой матрицы. В соответствии с данными последних научных исследований и собственных результатов сформулированы критерии включения/исключения доноров биологического материала для выделения МСК жировой ткани. Проводится сбор биологических образцов, выделение из них клеток, их наращивание, иммунофенотипирование и контроль контаминации, согласно разработанной в рамках проекта СОП. Из выделенных клеток сформирована охарактеризованная коллекция МСК жировой ткани человека для получения кондиционированной среды, содержащей продукты секреции клеток. На данном этапе с учетом международных рекомендаций разработан паспорт клеточного образца. Проведен анализ рынка на предмет поиска оптимальной среды для кондиционирования клеток, как способствующей поддержанию жизнедеятельности МСК жировой ткани и продукции ими биоактивных факторов, стимулирующих регенеративные процессы, так и перспективной с точки зрения коммерциализации разработки. Выбраны две среды, поддерживающих рост недифференцированных МСК, и отработана процедура получения субстанции, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани, с использованием этих сред. Результаты интеллектуальной деятельности (РИД), способные к правовой охране, на отчетном этапе не получены. По результатам, полученным на первом этапе проекта, была подготовлена и принята в печать в журнал "Урология" статья "Коллагеновые матрицы в реконструктивной урологии".
Полученные данные были доложены на ряде научных конференций:
1. IV Съезд физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 8-12 октября 2014 г., http://www.physiology-cis.org), устный доклад "Влияние факторов риска на стволовые и прогениторные клетки и процессы репарации и регенерации в организме";
2. III Межрегиональная научно-практическая конференция "Клеточные технологии - практическому здравоохранению 2014" (Екатеринбург, 16 октября 2014 г.) устный доклад "Аутологичная клеточная терапия: влияние факторов риска на стволовые и прогениторные клетки";
3. IV Международная научно-практическая конференция "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине" (Казань, 29 октября - 1 ноября 2014 г.,http://www.postgenome.ru/ru) постерный доклад "Adipose-derived stromal cell for autologous cell therapy: disturbed angiogenic activity in patients with coronary artery disease and diabetes mellitus type 2" и устный доклад " Physiological regulation of tissue repair and regeneration".
  Кроме того, доклад о ходе реализации проекта был представлен на отчетной научно-практической конференции "Реализация прикладных научных исследований и экспериментальных разработок по приоритетному направлению "Науки о жизни" в 2014 году в рамках федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы" (Москва, 1-2 декабря 2014 г., http://xpir.fcntp.ru/activities/8a2733a61fd142f6ae3be5991ba6c46c) Полученные на первом этапе результаты соответствуют техническим требованиям к проекту и будут использованы на следующих этапах проекта для стандартизации кондиционированной среды МСК жировой ткани человека, подбора оптимальных видов коллагеновой матрицы и разработки методов проверки нового материала на моделях in vitro и in vivo.

Второй этап проекта
   В ходе выполнения второго этапа проекта выполнялись следующие работы:
разработка и стандартизация методов контроля качества субстанции на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека; разработка стандартных операционных процедур (СОП) контроля качества субстанции на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека; наработка образцов кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека, полученных от 30 доноров и сравнительный анализ полученных образцов; выбор оптимальных типов коллагеновой матрицы.
  При этом были получены следующие результаты:
  Были отработаны методы контроля качества субстанции, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека, и проведен анализ наработанных образцов с целью стандартизации субстанции. В перечень показателей контроля качества были включены как общепринятые индикаторы качества биофармацевтических продуктов, так и новые, предложенные на основе собственных экспериментальных данных, показатели. Анализ различных бессывороточных сред и подбор оптимальных условий получения кондиционированной среды от МСК жировой ткани человека, а также включение значительного числа доноров и оценка вариабельности образцов по выбранным показателям отличает результаты исследования от аналогичных работ по использованию продуктов секреции МСК для стимуляции регенерации. На этом этапе были также подобраны типы и формы коллагеновых матриц для дальнейшего получения комбинированного биоматериала, стимулирующего регенерацию на разных моделях in vivo.
  Для выполнения работ на втором этапе был продолжен сбор биологического материала от доноров для выделения МСК из подкожной жировой ткани и наработки образцов субстанции, содержащей продукты секреции этих клеток. Полученные образцы субстанции от 30 доноров были проанализированы, согласно разработанным на данном этапе методикам контроля качества субстанции, которые были зафиксированы в соответствующих СОП. Показано, что большинство наработанных образцов субстанции соответствует заданным параметрам качества и может быть использовано на дальнейших этапах проекта. На основании полученных данных были уточнены и оптимизированы некоторые этапы технологического процесса производства субстанции на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека, стандартизованы показатели контроля ее качества, выдвинуты предпосылки для возможной замены биологических методов оценки специфической активности субстанции инструментальными методами. На данном этапе были протестированы различные типы коллагеновой матрицы (гель, мембрана, губка) разного происхождения (бычий, свиной, человеческий) на моделях in vivo с целью выбора оптимальных типов коллагена для каждой модели. Были подобраны типы коллагеновых матриц, условия их применения и проведена оценка иммунологической реакции тканей на ксеногенный коллаген на моделях кожной раны (мыши), дефекта стенки мочевого пузыря (кролики) и при введении под белочную оболочку яичка (крысы). Результаты интеллектуальной деятельности (РИД), способные к правовой охране, на отчетном этапе не получены.
  Полученные данные были доложены на II Российском национальном конгрессе «Трансплантация и донорство органов» (Москва, 8-10 июня 2015 г., http://transpl.ru/about_center/rto/events/ii_rossijskij_nacionalnyj_kongress_transplantaciya_i_donorstvo_organov/), пленарный доклад «Фундаментальные и клинические проблемы клеточной терапии».
  Полученные на втором этапе результаты соответствуют техническим требованиям к проекту и будут использованы на следующих этапах проекта для отработки методов очистки и стабилизации кондиционированной среды МСК жировой ткани человека, подбора оптимальных способов комбинации кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека с отобранными коллагеновыми матрицами и разработки методов проверки нового материала на моделях in vitro и in vivo.

Третий этап проекта
   В ходе выполнения третьего этапа проекта выполнялись следующие работы:
отработка методов очистки и стабилизации субстанции на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека; разработка СОП очистки и стабилизации субстанции с помощью ультрафильтрации и лиофилизации; разработка лабораторного регламента производства субстанции; выбор методов контроля регенераторной активности разрабатываемого материала.
  При этом были получены следующие результаты:
Были отработаны методы очистки субстанции на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека с помощью ультрафильтрации через мембраны с различным размером пор. Показана важность высокомолекулярной фракции для сохранения биологической активности субстанции. Для стабилизации субстанции подобран протокол лиофилизации и заложены образцы субстанции на длительные сроки хранения для оценки стабильности. Отработанные методики очистки и стабилизации субстанции были зафиксированы в соответствующих СОП. В течение этапа был продолжен набор клеточного материала и наработка экспериментальных образцов субстанции. На основании полученных на третьем и предыдущих этапах данных подготовлен лабораторный регламент производства субстанции на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека. Были также подобраны несколько in vitro методов контроля регенераторной активности комбинированного материала на основе секреторных продуктов МСК и коллагена, отражающих взаимодействие материала с различными типами клеток, вовлеченных в процессы репарации и регенерации тканей при повреждении. Проведена проверка применимости этих методов в зависимости от использования различных форм коллагеновых матриц.
  На данном отчетном этапе были получены РИД, способные к правовой охране: была подана заявка на патент на изобретение «Способ получения средства для стимуляции регенерации на основе продуктов секреции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека» (№2015154800 от «21» декабря 2015 г., РФ).
  Полученные данные были доложены на Научно-практической конференции по итогам реализации в 2015 году прикладных научных исследований и экспериментальных разработок по приоритетным направлениям в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на2014 – 2020 годы»
https://xpir.ru/conference2015
  По результатам, полученным в ходе выполнения проекта, были подготовлены и опубликованы:
Сагарадзе Г.Д., Григорьева О.А., Ефименко А.Ю., Чапленко А.А., Суслина С.Н., Сысоева В.Ю., Калинина Н.И., Акопян Ж.А., Ткачук В.А. Терапевтический потенциал секреторных компонентов мезенхимных стромальных клеток человека: проблема стандартизации, Биомедицинская химия, №6, Т.61, 2015 (http://pbmc.ibmc.msk.ru/index.php/ru/issues/PBMC-2015-61-6)
Anastassia Efimenko, Georgiy Sagaradze, Zhanna Akopyan, Tatiana Lopatina, Natalia Kalinina Data supporting that miR-92a suppresses angiogenic activity of adipose-derived mesenchymal stromal cells by down-regulating hepatocyte growth factor, Data in Brief, Volume 6, March 2016, Pages 295–310 (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235234091500387X)
  Полученные на третьем этапе результаты соответствуют техническим требованиям к проекту и будут использованы на следующих этапах проекта для подбора оптимальных способов комбинации кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека с отобранными коллагеновыми матрицами и разработки методов проверки нового материала на моделях in vitro и in vivo.

Четвёртый этап проекта
   В ходе выполнения четвертого этапа проекта выполнялись следующие работы: выбор оптимального способа и режимов связывания субстанции на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека с выбранными типами коллагеновых матриц; разработка материала; подбор оптимальных условий и срока хранения материала; разработка и стандартизация методов контроля качества материала; разработка СОП лабораторной наработки материала; разработка лабораторного регламента производства материала; наработка экспериментальных образцов материала; разработка технико-экономического обоснования (ТЭО) создания медицинских изделий из разрабатываемого материала.
При этом были получены следующие результаты: были исследованы разные подходы к комбинированию субстанции на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека с различными коллагеновыми матрицами. Была показана необходимость концентрирования субстанции и отработана методика концентрирования. Были подобраны методы связывания концентрированной субстанции с коллагеновым гелем, коллагеновыми повязками и коллагеновыми мембранами, зафиксированные в соответствующих СОП, а также проведена оценка регенераторной активности образцов комбинированного материала и скорости высвобождения секреторных компонентов МСК жировой ткани человека из коллагеновой матрицы. Были подобраны методы контроля качества комбинированного материала на основе секреторных продуктов МСК жировой ткани человека и различных форм коллагеновых матриц. На основании полученных данных были подготовлены лабораторный регламент производства материала на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека и коллагена, а также технико-экономическое обоснование производства медицинских изделий из разрабатываемого материала.
  Полученные данные были доложены на Форуме «Биомедицина-2016» http://biomed2016.icg.nsc.ru/main (26 июня-1 июля 2016 г., г Новосибирск, РФ) и Международной конференции «International Conference Cell Technologies at the Edge: Research & Practice/ Recent Achievements in Stem Cell Research» http://cterp.org (6-8 апреля, г. Санкт-Петербург, РФ).
  Полученные на четвертом этапе результаты соответствуют техническим требованиям к проекту и будут использованы на следующих этапах проекта для разработки программы и методик лабораторных испытаний экспериментальных образцов разрабатываемого материала на моделях in vitro и in vivo и проведения этих испытаний.

Пятый этап проекта
   В ходе выполнения пятого этапа проекта выполнялись следующие работы: разработка программы и методик исследовательских испытаний, включающие in vitro и in vivo исследования, экспериментальных образцов материала как средства, стимулирующего регенерацию при лечении кожных повреждений, урологических и андрологических патологий, и проведение этих испытаний, согласно разработанной программе; наработка экспериментальных образцов материала для проведения лабораторных испытаний; разработка проекта технического задания на продолжающие работы; разработка технических требований и предложений по разработке и производству медицинских изделий из материала.
  При этом были получены следующие результаты: были разработаны программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов материала на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека и коллагена на различных моделях in vitro и in vivo. Испытания экспериментальных образцов материала в трех различных формах (гель для инъекций, повязка, плотная мембрана), наработанных согласно разработанному ранее лабораторному регламенту, были проведены на клеточных моделях in vitro (миграция и пролиферация фибробластов кожи, эндотелиальных клеток, оценка выживаемости клеток в неблагоприятных условиях, взаимодействие с иммунными клетками, динамика высвобождения факторов роста) и на животных моделях кожного повреждения (мыши), нарушения сперматогенеза (крысы) и уропластики (кролики). Показана эффективность применения разработанного материала для ускорения заживления кожных повреждений, замещения дефекта стенки мочевого пузыря с восстановлением его функции, а также стимуляции восстановления сперматогенеза при введении материала в яички. Кроме того, на данном этапе были разработаны проект технического задания на продолжающие работы и технические требования и предложения по разработке и производству медицинских изделий из материала.
  Таким образом, в результате выполнения проекта была разработана технология получения нового биоматериала на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека и коллагена в трех различных формах (гель для инъекций, повязка, плотная мембрана). Разработанный материал был успешно апробирован на экспериментальных моделях для лечения повреждений кожи, стенки мочевого пузыря и восстановления фертильности и может быть использован для замещения поврежденных тканей и стимуляции регенеративных процессов. В рамках проекта была также разработана нормативно-техническая документация, необходимая для дальнейшей доработки материала и внедрению полученных результатов в клиническую практику. Полученные результаты соответствуют требованиям технического задания и плана-графику работ по проекту.
  На данном отчетном этапе были получены РИД, способные к правовой охране: были поданы заявка на патент на изобретение «Способ определения бактериальной контаминации биоматериалов» (№2016149615 от «19» декабря 2016 г., РФ) и «Способ стимуляции сперматогенеза продуктами секреции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека» (№2016151259 от «26» декабря 2016 г., РФ). По результатам, полученным на данном этапе, были подготовлены 2 статьи.
  Полученные данные были доложены на Международных конференциях TERMIS-AP 2016 (3-6 сентября 2016 г., Тайпей, Тайвань) и StemCelBio-2016 (9-11 ноября 2016 г., Санкт-Петербург), а также на отчетной конференции ВУЗПРОМЭКСПО-2016 (14-15 декабря 2016 г., Москва).
Полученные результаты соответствуют требованиям технического задания и плана-графику работ по проекту.

Назад


Рус Eng Поиск Вк Telegram Адрес Тел                             
Мобильная версия

Яндекс.Метрика